染色体非整倍体畸变的产前诊断研究进展

唐　宁

(柳州市妇幼保健院,广西柳州545001)

　　[关键词]产前诊断;染色体;研究进展

　　[中图分类号]R714.15　[文献标识码]B　[文章编号]167125098(2008)0921120203

Study Progress of Chrom osom e Aneuplo i dy i n Prena t a l D i a gnosis

T ANG N ing

(M aternal and Child Health Hospital of L iuzhou,L iuzhou,Guangxi545001,China)

　　Key words:Prenatal diagnosis;Chr omos ome;Study p r ogress

　　染色体非整倍体是指细胞的染色体数目多或少了一条或多条。非整倍体畸变可分为单体型、三体型、多体型、嵌合体。临床上常见的非整倍体畸变包括了21三体综合征(Down综合征)、18三体综合征(Ed wards综合征)、13三体综合征(Patau综合征),以及一些性染色体畸变,例如X单体(Turner 综合征),或性染色体三体,如47XXX(X三体综合征)、47XXY(Klinefelter综合征)、47XYY(XYY综合征)等。多年研究表明13、18、21及X,Y非整倍体占新生儿染色体数目异常的95%。在这类遗传病中,在胎儿期常有流产、死胎、畸胎等,患儿可表现为先天智力低下、生长发育迟缓,常伴有五官、四肢、内脏等方面畸形,对家庭和社会造成重大危害。基于这点,学者们在不断地寻求各种诊断方法来避免这类患儿的出生。

近年来,随着多学科不断发展并相互渗透,使得产前诊断技术不断提高,快捷和准确是发展方向。目前常用的有非浸入性产前诊断方法和浸入性产前诊断方法。

1　非浸入性产前诊断方法

1.1　孕妇外周血中胎儿游离的DNA和RNA　1997年Lo[1]等利用PCR技术在妊娠12周～40周孕期男性胎儿的孕妇血浆和血清中检测到睾丸决定基因(SRY)的特异性序列,确定了胎儿游离的DNA的存在,为非浸入性产前诊断提供了一条新途径。他们研究发现胎儿的染色体核型可以影响母体循环中胎儿DNA的数量,如怀有21三体胎儿或18三体胎儿的孕妇血浆中胎儿游离的DNA明显增加。虽然胎儿游离的DNA 在产前诊断上有较好的前景,但它是以Y染色体特异性序列作为胎儿的DNA遗传标记,使得50%怀孕女胎的妇女不能有效的得到非浸入性产前诊断。

Poon I[2]等应用两步逆转录PCR(RT2PCR)技术在孕男胎的孕妇血浆中首次发现Y染色体特异性锌脂蛋白(ZFY)mR2 NA,证实了胎儿游离的RNA的存在,之后多名学者研究发现了多个胎盘源性mRNA,即人类胎盘生乳素(HP L)mRNA、人类绒毛膜促性腺激素β亚单位(β2HCG)和促肾上腺皮质激素释放激素(GRH)mRNA,使得胎儿游离的RNA成为非浸入性产前诊断的候选标志物。已有学者应用β2HCG mRNA和GRH mRNA对18三体综合征进行诊断,在18三体综合征孕妇外周血中β2HCG mRNA明显低于正常对照组,GRH mRNA 则明显高于正常对照组。

尽管胎儿游离的DNA和RNA在产前诊断安全性高且简单快速,易于被孕妇接受,但仍有一些问题需要解决,如胎儿游离DNA和RNA的来源及清除机制不甚清楚,胎母游离的RNA稳定性机制及需要寻找更多的胎源性DNA和RNA标记物来诊断临床各类遗传病及妊娠相关疾病。

1.2　孕妇外周血中胎儿细胞　孕妇血中胎儿细胞包括了滋养细胞、淋巴细胞、粒细胞和有核红细胞(nRBCs)。其中有核红细胞携带了完整的胎儿基因组,在妊娠期间持续存在于母血循环中,便于采集,可作为产前诊断的理想细胞。B ischoff 等[3]用流式细胞仪采集孕妇外周血中胎儿细胞后,用五色荧光原位杂交技术(F I SH)同时测13、18、21及X,Y染色体片段,用来确定细胞的来源及是否存在染色体数目畸变,结果检出2例21三体,并经出生诊断证实。

孕妇外周血中胎儿细胞虽然在非浸入性产前诊断有应用,但存在着细胞少且有母源性细胞污染的可能,必须解决好采集、分离、纯化,才能更好地应用于产前诊断。

1.3　宫颈脱落滋养层细胞　1971年Shettle首先报道取早孕妇女宫颈黏液涂片染色,发现存在脱落的绒毛细胞,1997年Rhine发展了一种从宫腔收集滋养层细胞。我国学者李守柔、马旭等[4]用收集脱落的滋养层细胞预测胎儿性别,诊断21三体等,提示经宫颈收集滋养层细胞可能是一种安全可靠的孕早期产前诊断方法。

目前各种分子生物学、遗传学及免疫细胞化学技术均证实在宫颈脱落细胞确实存在胎儿滋养细胞,但宫颈脱落胎儿滋养细胞用于产前诊断还处于临床试验阶段,而需解决的问题如进一步评价取材的方法、部位及途径,进一步评价是否有最佳取材时间及其他影响因素等。它作为非浸入性产前诊断方法,有潜在的应用价值。

1.4　遗传学超声检查　B超以其简便、无创伤、可重复性等优点在优生领域里有良好的应用,特别是遗传学超声检查。它主要以颈部厚度(NT)、肱骨长度(HL)、股骨长度(F L)、心脏回声异常以及脉络膜丛囊肿等指标作为染色体非整倍体异常的产前检查[5]。NT被认为是21三体综合征最有效的遗传

3课题:广西医疗卫生科研课题(编号:桂卫Z2007265)学超声指标,此项在21三体综合征胎儿中常有增大。13三体和18三体综合征的B超异常较21三体多见,B超对这两者的检出率约70%～80%,常用的指标为脉络膜丛囊肿,心脏畸形、单脐动脉等[6,7]。性染色体异常如Turner综合征的B 超检查主要以囊状淋巴瘤为主要特征性表现,其次为胎儿水肿、羊水过少等。

B超检查的所有指标均为非特性的,故主张采用多指标联合筛查,并联合生化指标可提高染色体非整倍体畸变的检出率。

2　浸入性产前诊断方法

浸入性产前诊断主要包括孕早期的绒毛产前诊断、孕中期的胎儿脐血的产前诊断、羊水的产前诊断[8]。这几项技术是在超声引导下进行的胎儿样本的采集,对母儿有创伤性损害。所采集到的胎儿样本可用于细胞遗传学及分子生物学等方面的诊断。浸入性产前诊断虽然存在一定的创伤性及胎儿丢失风险,但由于结果较可靠,仍然被接受。

3　产前诊断的实验室技术

3.1　染色体核型分析技术　1969年出现了染色体显带技术,所谓染色体显带是沿着整个染色体的长轴,能显现出着色深浅不同的条带。预先用热、碱、胰酶、尿素、去污剂或者某些盐溶液处理染色体标本,然后用Gie m sa染色显带称“G”带。从20世纪60年代末期开始,人们利用收集到的羊水细胞进行产前诊断,通过分离外周血中的淋巴细胞进行染色体异常疾病的诊断。所用的检材还可以是胎儿的脐血或胚胎绒毛组织。潘小英[9]等应用了一套改良的羊水细胞培养技术即羊水细胞原位培养染色制备技术,诊断出4例21三体综合征、1例13三体综合征和1例Turner综合征。

染色体核型分析技术虽然是“金标准”,但分析结果时往往依赖获取物的质量,如果样本细胞量小或被污染,则很难或不能出结果;另外这种方法需要冗长的实验程序和高额的费用,技术要求高,对于羊水来源标本,大约需要13.8d～20.2 d的时间才可以获得分析结果,而对于绒毛膜标本,大约需要14.5d～21.4d,由于所需时间较长,往往给孕妇造来较大的心理负担,有引起流产的可能。另外,对于<5Mb的微小染色体改变是无法检测出来的,对于嵌合体来说,异常细胞所占的百分比<10%,也无法通过染色体核型分析技术检测出来。由于检测耗时长,对于技术人员要求高等等,它也无法用于大规模的筛查。

3.2　荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridizati on,

F I SH)　F I SH是以荧光标记取代同位素而形成的一种新的原位杂交方法,是根据单链DNA分子(探针)与细胞水平制备物(如中期染色体或间期核)上的变性互补序列(靶序列)在特异位点退火的特性来进行的,在探针与靶序列退火后,经荧光检测步骤,就可在杂交位点上观察到所要研究的序列。在胎儿染色体数目异常的产前诊断中,主要采用绒毛或羊水间期细胞的F I SH来进行快速诊断[10]。应用X、Y和18号染色体的着丝粒探针和13号、21号染色体的单一序列探针对绒毛和羊水间期细胞进行F I S H分析,在间期细胞核中,若X 探针和Y探针均出现一个杂交信号,则表明胎儿为男性,若出现两个X探针的杂交信号,而Y探针无杂交信号,则表明胎儿为女性,若13号、18号、21号染色体的探针均出现两个杂交信号,则表明该染色体为二倍体,若某一探针出现三个杂交信号,则表明胎儿为该染色体的三体型,从而能够对大多数胎儿染色体异常作出快速产前诊断,该法简便、有效、准确性高,24h即可发报告,具有实用价值。赵丽[11]等利用此技术对36例常规核型分析疑有染色体异常的外周血样本和45例产前诊断羊水样本进行F I S H检测,检出14例Turner综合征、13例47,XXY,2例47,XYY,1例47,XXX,1例47,XX,+21, 1例47,XX,+18,4例结构异常。楚伟[12]等采用F I SH技术对9例产前诊断病例的绒毛组织和12例自然流产病例的绒毛组织进行检测,产前诊断样本检出1例13三体综合征,自然流产病例样本检出三例异常核型分别为46,XX/47,XX,+ 16;46,XY,Y≈18;46,XY/92,XXYY。

F I SH用于未培养的羊水间期细胞染色体检查,可排出培养造成的假嵌合体现象。值得注意的是,对易位型21三体,卫星顺序探针和涂染探针有假阴性的可能。所以,F I SH的结果并不是最终诊断,必须同时进行羊水或绒毛细胞培养,进行染色体核型分析来对F I SH的结果进行核对,以染色体核型结果作为最终诊断,在绝大多数情况下,切不可以间期F I SH的结果来作为临床处理的依据。由于间期F I S H具有快速简便和准确性高等特点,作为传统的细胞遗传学诊断的辅助手段,是具有很好的临床应用价值的,在实际临床实践中,应对该方法的性质、适应征和优缺点有明确的了解,根据实际情况,并且在患者知情同意的前提下,来进行间期F I SH分析。

3.3　STR2PCR技术　此法是通过对染色体上一些特异的多态性ST R标记进行PCR扩增,经电泳、银染色分析等,用于13、18、21三体或性染色体非整倍体的检测[13]。安娜[14]等应用STR2PCR对51个家系174例样本扩增21号染色体4个位点、13号、18号染色体各3个位点,并与染色体核型结果比对。结果检出16例21三体、13、18三体各1例。但1例罗氏易位和1例嵌合体未能检出。孙筱放等[15]也用此技术分三个反应体系对产前诊断样本进行13、18、21三体或性染色体非整倍体的检测,检测结果与染色体核型分析结果有很高的符合率。

3.4　定量荧光多重PCR技术(quantitative fluorescence multi2 p lex poly merase chain reacti on,QF2multi p lex PCR)　定量荧光多重PCR技术是对同一模板应用一对以上的荧光标记引物同时扩增不同区域,扩增片段应用遗传分析仪进行电泳后分析,该分析仪可以达到2bp分辨率,应用相关软件如GeneS2 can可以计算每一个等位所代表的扩增量[16,17]。1991年首次应用QF2PCR成功检测了X染色体的差异。M ansfield等人对此方法进行了修改,应用ST R位点(short tande m repeat,短串连重复序列)进行QF2PCR,检测了21、18和X三体综合征。随后1994年科学家们应用扩增STR的QF2PCR技术对各种不同来源的样本如羊水、绒毛活检和胎儿血样等进行了21三体综合征的检测。1995年后人们开始联合多个染色体上的特异性ST R位点同时对21三体、18三体、X Y染色体异常进行诊断。QF-PCR可以在24h～48h内完成分析,相比F I SH 而言,缩短了诊断时间,从而减轻了孕妇的心理压力;只需要少量细胞,甚至可在单细胞水平同时诊断性别和单基因缺陷;可以同时分析父亲DNA及母亲DNA,可辩别额外染色体的来源,区分减数Ⅰ或Ⅱ错误;可分析少量分离的胎儿基因,还可用于胚胎种植前诊断;由于所需扩增的目的片段较小,都在75bp～400bp,适于扩增,鉴于以上原因,可以适于大规模检测,更客观,更少劳动强度,可自动化,可满足孕妇对产前诊断结果的急切需要。藏春霞[18]等应用此技术对50例例正常无关个体及9例羊水样本、3例血清学筛查高危的胎儿羊水样本,13、18、21、X/Y染色体上的短串联重复序列(STR)进行检测分析,运用的ST R为:D13S631、D13S634、D13S742、D18S386、D18S391、D18S535、D21S11、D21S1270、I F2 NAR、X22、XHPRT。结果检出了18,21三体各1例,检出Klinefelter综合征1例。杨昕等[19]选用21号染色体上7个STR位点即D21S1433、D21S1442、D21S1444、D21S1411、D21S1412、D21S1413、D21S1414,运用QF2PCR对250例羊水标本进行检测,检出24例21三体综合征。该技术不能对染色体结构异常进行分析,对嵌合体存在漏检。

3.5　引物原位标记技术(p ri m ed in situ labeling,PR I N S)　此技术具有F I SH的直观性和PCR的特异性和灵敏性。末标记引物与染色体原位杂交后,在聚合酶的作用下,掺入标记核苷酸,合成标记的DNA链,通过免疫细胞化学法和荧光显微镜对标记位点进行检测。与传统的细胞遗传学相比,PR I N S具有判断染色体数目的优势。与F I SH相比,PR I N S又具有简便、快速、特异性强、经济及细胞形态完整的优点,并可鉴别F I SH诊断中具有高度同源着丝粒探针的13号与21号染色体。所以,PR I N S为产前诊断提供了一种迅速、有效的方法。倪斌等[20]用PR I N S技术在8例女性外周血淋巴细胞培养样本中检测了X、18号染色体,从而证实了PR I N S是一种较简单、快捷、特异的染色体检测方法,可用在产前快速诊断染色体非整倍体。舒群等[21]用PR I N S对16例脐血样本、34例外周血进行染色体检测,结果检出3例18三体,并与染色体核型分析结果一致。

3.6　实时定量PCR　实时定量PCR的原理是利用Taq酶5′→3′外切酶功能,加入1个5′端标有荧光发射基因,3′端标有荧光淬灭基因,与模板特异杂交的探针。复性期探针完整地与模板杂交,荧光信号被淬灭。当复制链移到探针处,Taq酶发挥外切酶活性,切断探针,解除淬灭,释放荧光信号。由于被释放的荧光基团数目和PCR产物数量成正比,因此该技术可对模板准确定量。郑明明等[22]用实时定量PCR对85例唐氏综合征筛查高危孕妇的羊水、7例智残儿外周血样本进行21号染色体上特异性区域基因片段(DSCR3)和管家基因片段(G AP DH),并计算二者比值,同时采用染色体核型分析。结果有5例羊水样本及7例智残儿外周血样本DSCR3/G AP2 DH比值明显高,经染色体核型分析均为21三体。实时定量PCR方法避免了PCR后污染,省时省力,更适合产前诊断。但不能作为常规的方法,还需要大规模样本的研究。

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(收稿日期:2008201220)