荧光定量PCR服务

一.引物和探针的设计

1.公司专利的Beacon技术（针对microRNA的检测）。

a.将mRNA序列转换成DNA序列。取3’末端5～6个碱基的区域，使之退火温

度达到16℃（按照A、T=2℃;C、G=4℃的原则计算）。并用oligo 6 写出mRNA

的反向互补序列。（方法：将序列粘贴至oligo 6，用“Change”选项中的

“Strands”。）

b.正向引物的设计：

先根据mRNA的部分序列设计正向引物，长度为15个碱基左右序列与mRNA 一致，5’端与mRNA的5’端起始碱基一致，使当前引物退火温度达到40～42℃，

在引物的5’末端添加碱基，最终使引物退火温度达到56℃左右，计算原则同上。

引物总长尽量短。

注意：检查正向引物自身形成的二聚体。3’端互补不超过3个碱基。

c.Beacon探针的设计：

将mRNA反向互补序列的16℃部分连同后面的2～3个碱基（注意：这2～3个碱基与正向引物的重叠不超过三个碱基。）复制下来，然后在此序列前后部分别

添加相应的互补序列，作为“茎环结构”中的“茎”部分，此结构必须严格配对，目前通用序列为CGCAGG和CCTGCG，可供参考。在序列和前半部分的茎序

列之间应添加若干碱基，使Beacon探针的退火温度达到60℃左右。当然也可在此

序列后部和后半半部分的茎序列之间添加，但要注意和正向引物的重叠。

注意：用oligo 6软件不时的检查茎环结构是否存在，以及此探针和已设计完的正

向引物之间的二聚体情况。

d.茎环结构逆转录引物的设计：

用Beacon探针的前部茎环节构序列参与“茎”的部分，即GGCCCTG和GCCAGCG。然后在反向引物和探针序列之间添加2～3个碱基，长度在40个碱

基左右。目前通用序列为：

GGCCCTGA CATCAGATGTGTTGGCTA TACG＋探针除了后半部分“茎”序列

的部分，可供参考。

注意：需检查所设计引物的结构情况。

e.反向引物的设计：

在上述茎环节构逆转录引物前端取20个碱基左右的序列，作为反向引物的序列，退火温度在54~56℃。例如：CATCAGATGTGTTGGCTA，可供参考。

注意：设计完成之后，检查其自身互补、与正向引物和Beacon探针的互补情况。

2.普通引物的设计（针对待检基因）

a.搜索基因相关信息

根据客户所提供的基因编号，在NCBI上查出该基因的相关信息，以文本的形式先保存下来。

b.运用oligo 6设计相应的引物

在上述从NCBI上摘录的信息中找到该基因的编码区位置，即“CDS”这一部分的

序列，将其复制下来，打开oligo 6把复制的序列粘贴上去，并“Accept”。点击

“Change”菜单选中第一项“Current Oligo Length”，设定其长度为20个碱基。

然后选择“Search”选项的第一项“For Primers and Probes”，在弹出的对话框中

选中“Search Ranges”，把PCR产物的大小设为100～150个碱基，最后点击“OK”

开始搜索。

c. 选择适当的引物

一般应选择该序列中后部的引物，尽量靠近后部，再用“Analyze”选项里的“Duplex Formation”分析正向引物之间、反向引物之间以及正反向引物之间的二

聚体形成情况，引物3’末端互补的碱基不超过3个。

二. 客户样品

组织或细胞样品

a. 收到样品后立即置于-80℃冰箱冷冻保存。等到用时再取出，操作时尽量缩短

样品暴露在室温状态下的时间。

b. Total RNA抽提：

往离心管中加入500ul Ezol，匀浆（如样品为细胞，则不需匀浆，直接加1ml Ezol至离心管中）。

称取适量的组织样品（一般为10～20mg左右，细胞样品则不需要称重。）于2ml 离心管中。

匀浆后补加500ul Ezol，将离心管上下颠倒混匀，室温放置10min。

加入200ul RNA专用的三氯甲烷，上下颠倒混匀，直至离心管中的液体彻底混匀，成乳白色状。

室温放置5min，12000rpm/min离心15min。

小心将上清转移至另一干净的1.5ml离心管中，切勿吸动中层蛋白相和下层有机相。

往上清中加入500ul预冷的RNA专用的异丙醇，室温放置5min。10000rpm/min离心10min。

小心弃尽上清，加入1ml RNA专用的75％的乙醇洗涤沉淀，10000rpm/min离心10min。

小心弃尽上清，置于室温晾干乙醇，加入适量的DEPC水溶解，混匀。

注意：上述步骤中所用离心管均经DEPC水处理。试剂均为RNA专用试剂。抽提人员需带上手套和口罩。用移液器吸上清时头切勿触碰RNA沉淀所在的一侧管壁。

c. RNA电泳：将按上述步骤抽提的total RNA 取适量的体积进行1％琼脂糖凝胶电泳。分析结果，评价抽提质量。

注意：完整的total RNA应包含清晰的28s，18s和5s三条带形，28s与18s的总量比应为2：1。

RNA样品

收到样品后立即置于-80℃冰箱冷冻保存。等到用时再取出，操作时尽量缩短样品暴露在室温状态下的时间。

cDNA模板的制备

Total RNA逆转录：

将上述抽提得到的或者客户直接送来的total RNA进行逆转录，制备cDNA模板。

注意：1. 上述表格中RT Primer的终浓度为1uM，稀释均用DEPC水稀释。

2. 检测的样品包括1μM miRNA标准品，1nM miRNA标准品和总RNA。

3. 表格中所提供的为逆转录20ul的体系，可根据实际需要按比例扩大该体系。

4. buffer与盨应的逆转录酶对应，如更换逆转录酶则需注意新的buffer浓度以及逆转录酶的活力单位。逆转录酶快用快放，保存于-20℃。

5. 可根据需要比相应的管数多配1～2管的量。

6. 逆转录后的cDNA于-20℃保存。

b. 逆转录反应条件：

（1）如用公叨专利的beacon技术，反应条件为：16℃30min；42℃30min；

85℃10min。

一般逆转录则用42℃30min；85℃10mi n即可。

备注：所用仪器为FTC-200 。

c.FTC-2000使用方法（逆转录时）：

用公司专利的beacon技术时，直接运行名为miRNA-RT的程序。

普逊逆转录则直接运行名为RT-normal的程序。

荧光定量PCR检测

cDNA模板的稀释：

将上述逆转录后得到的cDNA按自身需要进行稀释，考虑因素与cDNA的浓度以及需要检测的基因数盨关。通常情况下稀释3倍，例如：往20ul的体系中加入40ul ddH2O。

2. 荧光定量PCR：

a. 荧光定量PCR佃系（染料法）：

2.引物终浓度为200nM。

3. cDNA模板暂时不用时可放4℃，如需过夜，则应放于-20℃冻存。

4. rTaq酶快用快放，保存于-20℃。

5. 如配的管数较多，由于移液器的误差，庄多配5～6管。

6. 每个待检基因都需作三重复。

2. 其余注意事项和上述染料法相同。

c. 荧光定量PCR反应条件：

（!）95℃3min；

（2）95℃15s；

（3）50℃30s（温度可根据实际情况调整。）；

（4）72℃30s；

第2至第4步共40个循环。

备注：所用仪器为MX3000P。

d.MX3000P的使用：

（1）开机器背部电源。

（2）双击桌面上MX3000P的程序。

（3）在弹出的窗口中选择第一项：Quantitative PCR（Multiple Standards）”。

（4）选中“Setup”标签，在次级标签“Plate Setup”中根据所放样品的位置选择相应的孔和适当的荧光种籫（我们公司现采用FAM检测，用ROX作为校准荧光）。

（5）次级标签“Thermal Profile Setup”中选择合适的温度程序。

（6）设置完孔位和温度后，选中“Run”标签，点击工內栏上“lamp on/off”

按钮，预热，在弹出的小对话框中选中“Turn lamp off at the end of run”，再点击“Start”。选择合适的目录和文件名后在新弹出的对词框中点击“run now”

运行。

数据处理分析

1. 文件中切出所用试剂以及检测方法；

2. 将待检的样品名和基因名列成表格，填入三重复的Ct值，并求出平均值以及目

的样品和对照样品之间的一事比较参数，整理后发给客户。