实验八DNA的定量测定

学号：12050011012

实验八DNA的定量测定-二苯胺法 

一、实验目的

学习和掌握二苯胺测定DNA含量的原理和方法。

二、实验原理

DNA分子中的脱氧核糖基，在酸性溶液中变成ω-羟基-γ-酮基戊醛，与二苯胺试剂作用生成蓝色化合物（λmax=595nm）。

在一定波长范围，DNA浓度为20~200μg/ml范围内，化合物蓝色的深浅与DNA的含量成比例关系，即吸光度与DNA浓度呈正比，可用比色法测定。

三、实验仪器

1、试管

2、移液管

3、7220分光光度计

4、恒温水浴锅

5、锥形瓶

6、电炉

四、实验试剂

1、DNA标准液（200μg /ml）：称取10mgDNA钠盐溶于5mol/l氢氧化钠溶液并稀释至100ml。

2、二苯胺试剂：

A液：称取纯二苯胺1.50g，溶于100ml冰乙酸，再加浓硫酸1.5ml。贮于棕色瓶中。

B液：称取1.6ml乙醛溶于100ml蒸馏水中，临用时配制

临用时，将20mlA液和0.1mlB液混合即可。

3、DNA样液：将DNA粗品用蒸馏水溶解，控制其DNA含量在100μg/ml左右。

五、实验步骤

1、标准曲线的绘制

取干燥的试管6支，编号，按下表加入试剂：

2、样品测定

吸取DNA样液1.0ml，加入蒸馏水1.0 ml，加入二苯胺溶液4.0ml, 加毕，混匀，在60度水浴中保温45分钟，冷却后，在595nm波长下测吸光度，根据所测得的吸光度对照标准曲线求得DNA的质量(μg)。

分光光度计的使用方法：

1、连接仪器电源线，确定仪器供电电源有良好的接地性能。

2、接通电源，使仪器预热20分钟。

用键设置测试方式：投射比（T），吸光度（A），已知标准样品浓度值方式（C）和已知标准样品斜率（F）方式。

3、用波长选择旋钮设置所需的分析波长（500nm）。

将参比样品溶液和被测样品溶液分别倒入比色皿中，打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖。一般情况下，参比样品放在第二个槽位中。

4、将0％T校具（黑体）置入光路中，在T方式下按“0％T”键，此时显示器显示“000.0”

5、按 MODE键选择A模式

将参比样品拉入光路中，按“0A/100％T”键调0A/100％T，此时显示器显示的“BLA”直至显示“0.000”A为止。

6、当仪器显示器显示出“0.000”A后，将被测样品推入光路，这时，从显示器上得到被测样品的吸光度。

六、实验结果

1、标准曲线的绘制

试剂加毕混匀水浴前，溶液无色

水浴后，溶液呈蓝色，且蓝色依次加深

2、样品测定

先加入二苯胺溶液4.0ml，后加入DNA样液2.0ml，溶液分层，上半部分为白色浑浊状，下半部分透明无色。

混匀后，溶液澄清透明

水浴后，溶液呈蓝色，且蓝色依次加深

原始实验数据：

绘制标准曲线：

测定DNA样液的吸光度为0.134，带入标准曲线得样液中的DNA质量为139.0μg

求得样液中DNA的浓度为139.0μg/ml.

七、实验分析

1、本实验为定量实验。DNA分子中的脱氧核糖基，在酸性溶液中与二苯胺试剂作用生成蓝色化合物，蓝色化合物的多少与DNA的含量呈正比，且与溶液的颜色深浅呈正比。而溶液的颜色深浅与吸光度呈正比，因此用比色法测定样液中DNA的含量。

  2、 由于本实验是定量实验，因此对加入试剂体积的精度要求较高，实验产生的误差也大都由此引起。此外，移入试剂时要从一个试剂瓶中移出，防止因试剂浓度的差异引起误差。

3、在做二苯胺法测定DNA含量时，如果继续往试管里加蒸馏水则会产生白色混浊，     原因是：

二苯胺稍溶于水，溶于乙醇、乙醚、苯等，能溶于浓无机酸中，但用水稀释时又析出。

八、实验注意事项

1. 此方法测定DNA 含量灵敏度不高,若是DNA含量低于50ug/ml, 则难以测定。

2. 样品中少量的RNA并不影响测定, 但是蛋白质, 多糖及其衍生物, 芳香醛, 羟基醛等能与二苯胺反应成有机物,干扰DNA的定量。

九、思考题

1. 测定DNA含量的方法还有哪些?原理?

答：(1)紫外光吸收法:

组成核酸的碱基(G,A,T,C)在260nm处具有强吸收峰,所以通过测定260nm的吸收峰即可对DNA进行定量.但有时也会因为所处溶液的pH值不同而导致吸光系数的不同.因此,一般在中性pH值左右的环境中进行测定.这种方法常用于测定比较纯的样品.

(2)溴化乙锭荧光强度法:

当DNA含量很低以及样品中杂质含量高时,会影响紫外光吸收值的测定,这时,可以采用测定嵌入DNA中溴化乙锭分子受紫外光激发而发射出的荧光强度,因为这种荧光的强度与DNA总质量数成正比. 

2、实验中加入乙醛的作用是什么，请详细说明？

1. 可以提高二苯胺法中DNA的发色量；

2. 减少脱氧木糖和阿拉伯糖的干扰，提高灵敏度。