RT-PCR数据分析

1.以质量单位作为标准进行相对定量

条件：要求准确地量化初始材料，如细胞数目或核酸的微克数。

当用相对定量法比较多个样本时，选择一个样本作为校验样本（Calibrator，即对照），所有样本目标基因的表达都以对照为标准上调或下调。通常用未处理作为对照。

用试验样品和对照样品的CT值来计算两者的比率：

Ratio（test/calibrator）=ECT(calibrator)-CT(test)

2.以参照基因作为标准进行相对定量

用参照基因（B-actin等）的优点是能准确量化初始材料的载量，进行相对基因表达分析实验十分方便。在其他所有样本中目标基因的表达都相对于参照基因上调或下调。

方法一：2-△△CT（Livak）方法

条件：目标基因和参照基因扩增效率都接近100%且相互间效率偏差在5%以内。使用这个方法之前，必须检验目标基因和参照基因的扩增效率。

首先，对所有的测试样本和校准样本，用内参基因的CT值归一目标基因的CT值：

△CT（test）= CT（target，test）- CT（reference，test）

△CT（calibrator）= CT（target，calibrator）- CT（reference，calibrator）

其次，用校准样本的△CT值归一试验样本的△CT值：

△△CT=△CT（test）-△CT（calibrator）

最后，计算表达水平比率：        2-△△CT表达量的比值

如果目标和内参基因的扩增效率不相近，可以优化或重新设计实验，或者可以采用Pfaffl法。另外，如果目标基因和内参基因有相近的扩增效率，但是扩增效率不等于2，那么，2-△△CT（Livak）方法的公式可以修正为实际的扩增效率代替公式中的2。

方法二：Pfaffl法

条件：每个基因（目标和内参）在试验样本和校准样本中有相同的扩增效率，但是目标基因和内参基因制剂的扩增效率可以不同。

当目标基因和参照基因的扩增效率相差较大时，必须选择以下公式来测定不同样本中目标基因的相对表达量：

Ratio=（Etarget）CT，target（Calibrator — test）/（Eref）CT，ref（Calibrator — test）

等式中，Etarget 和Eref分别是目标基因和参照基因的扩增效率。