紫外和EMS诱变选育大肠杆菌赖氨酸营养缺陷型突变株的综合实验设计与实践

Experimental Technology and Management Vol.38 No.9 Sep. 2021

收稿日期: 2021-02-25

基金项目: 天津市教委科研计划项目（2019KJ175）

作者简介: 颜菲（1986—），女，山东济南，硕士，实验师，研究方向为生物医学工程，主要从事生物医学实验教学及实验室管理，

yanfeiaggie@126.com 。

通信作者: 潘皎（1977—），女，安徽门城，博士，副教授，研究方向为微生物学，panjiao@nankai.edu.cn 。

引文格式: 颜菲，毕平，张涛，等. 紫外和EMS 诱变选育大肠杆菌赖氨酸营养缺陷型突变株的综合实验设计与实践[J]. 实验技术与管理,

2021, 38(9): 204-209.

Cite this article: YAN F, BI P, ZHANG T, et al. Design and practice of comprehensive experiment of screening lysine mutants by UV and EMS induced mutagenesis[J]. Experimental Technology and Management, 2021, 38(9): 204-209. (in Chinese)

ISSN 1002-4956 CN11-2034/T

DOI: 10.16791/j.cnki.sjg.2021.09.041

紫外和EMS 诱变选育大肠杆菌赖氨酸营养缺陷型

突变株的综合实验设计与实践

颜 菲1，毕 平1，张 涛1，潘 皎2

（1. 天津医科大学 生物医学工程与技术学院，天津 300070；

2. 南开大学 生命科学学院，天津 300071）

摘 要：将科研项目成果应用于本科实验教学，设计了“紫外（UV ）和甲基磺酸乙酯（EMS ）诱变选育大肠杆菌赖氨酸营养缺陷型菌株（Lys –）

”综合实验项目。以大肠杆菌（E.coli DH5a ）为出发菌株，通过UV 和EMS 单一诱变和复合诱变的方法，利用青霉素法淘汰野生型菌株，采用逐个检出法进行初筛、划线对照法进行复检，通过传代培养检测Lys –突变株的遗传稳定性；对青霉素淘汰野生型菌株相关步骤重要参数的确定从原理和方法上进行探讨；通过优化UV 、EMS 诱变及复合诱变条件，对选育大肠杆菌Lys –突变株的高效诱变方法进行探讨。 关键词：实验教学；紫外；甲基磺酸乙酯；赖氨酸营养缺陷型；综合实验设计

中图分类号：G2.3；Q933 文献标识码：A 文章编号：1002-4956(2021)09-0204-06

Design and practice of comprehensive experiment of screening

lysine mutants by UV and EMS induced mutagenesis

YAN Fei 1, BI Ping 1, ZHANG Tao 1, PAN Jiao 2

(1. College of Biomedical Engineering and Technology, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China;

2. College of Life Sciences, Nankai University, Tianjin 300071, China)

Abstract: The results of scientific research projects have been applied to undergraduate experimental teaching, and a comprehensive experimental project of “Ultraviolet (UV) and ethyl methanesulfonate (EMS) induced mutagenesis and screening of Escherichia coli lysine auxotrophic strains (Lys –)” was designed. By taking E.coli DH5a as the starting strain, and using UV and EMS single mutagenesis and compound mutagenesis methods, the penicillin method is used to eliminate wild-type strains. The one-by-one detection method is adopted for preliminary screening, and streaking control method is used for replication. The genetic stability of the Lys – mutant strain is tested by subculture. The principle and method of determining the important parameters of the steps related to the elimination of wild-type strains of penicillin are discussed. By optimizing the conditions of UV , EMS and compound mutagenesis, the efficient mutagenesis method for screening E.coli Lys – mutant strains is discussed.

Key words: experimental teaching; ultraviolet; ethyl methanesulfonate; lysine auxotrophic strain; comprehensive experimental design

大肠杆菌结构简单，遗传背景清楚，是微生物学和遗传学研究的常用材料。相较于自发突变，人工诱

变可提高基因突变频率，被广泛应用于遗传育种研究[1]。常用的诱变剂主要包括物理诱变剂和化学诱变剂两大

类[2]。物理诱变剂主要有紫外线（UV）、X射线、快中子、伽马射线等，最常用的是紫外诱变。紫外线的波长为200~400 nm，对诱变最有效的波长为253~265 nm[3]。紫外诱变的主要生物学效应是使DNA发生断裂、碱基遭到破坏，导致同链DNA相邻嘧啶之间形成胸腺嘧啶二聚体结构，使碱基无法正常配对，从而阻碍DNA分子复制或引起碱基排列顺序改变，使得遗传基因发生变异，导致微生物突变或死亡[4]。化学诱变剂主要有烷化剂、叠氮化物、碱基类似物等。甲基磺酸乙酯（EMS）是一种高效、稳定的烷化剂，其作用机理是EMS分子中的活性烷基可以与嘌呤、嘧啶碱基分子中的H原子发生置换反应，即烷基化反应[5-6]）。DNA分子鸟嘌呤C6位是发生烷基化反应的主要位点之一，该位置在烷基化后会出现两种遗传效应：一是在DNA复制过程中，烷基化的鸟嘌呤与胸腺嘧啶配对，即由G：C配对变为A：T配对，导致碱基交换，造成点突变，这种突变是主要的突变类型[7]。二是烷基化的鸟嘌呤由于DNA分子上的糖苷键断裂而造成该位置缺失，在后续的DNA分子复制过程中，该位置可能被其他4种碱基所取代。EMS诱发具有突变频率高、染色体畸变少、对被诱变材料损伤小等特点，且多为显性突变，有利于突变体的筛选[8]。EMS 广泛应用于植物诱变育种，在微生物育种中研究报道较少。

本课题组致力于微生物诱变育种研究，已经建立复合诱变获得遗传性状稳定的不同中间代谢产物营养缺陷型的方法体系。本文结合笔者微生物实验教学的实践和经验，选择科研成果中部分具有探索性和趣味性的实验内容融入本科实验教学，将实验方法进行简化，设计成综合实验项目“紫外（UV）和甲基磺酸乙酯（EMS）诱变选育大肠杆菌赖氨酸营养缺陷型菌株（Lys–）”。该实验项目将从原理和方法上探讨青霉素淘汰野生型菌株相关步骤中重要参数的确定问题；并通过比较UV诱变、EMS诱变及UV-EMS复合诱变选育得到的赖氨酸营养缺陷型稳定菌株的检出率，探讨获得营养缺陷型菌株的高效诱变方法。

1 实验材料

1.1 菌种

大肠杆菌（Escherichia coli）：DH5a，购自天津为科生物技术有限公司。

1.2 培养基

培养基配方参考翟玉洁等人的文献[9]，并稍作调整和改进。

完全培养基（CM）：牛肉膏 0.5 g、蛋白胨 1 g、NaCl 0.5 g，蒸馏水100 mL，pH 7.2，高压灭菌0.1 MPa，121 ℃，20 min。固体培养基添加琼脂2 g/100 mL。

加倍完全液体培养基（2×CM）：牛肉膏0.5 g、蛋白胨1 g、NaCl 0.5 g，蒸馏水50 mL，pH 7.2，高压灭菌0.1 MPa，121 ℃，20 min。

基本培养基（MM）：葡萄糖2 g、(NH4)2SO4 0.4 g、尿素0.1 g、K2HPO4 0.05 g 、MgSO4·7H2O 0.05 g、FeSO4·7H2O 0.02 g、MnSO4·H2O 0.02 g、D-生物素50 μg/mL、维生素B1 2 μg/mL，蒸馏水100 mL，pH 7.0~7.2，高压灭菌0.1 MPa，105 ℃，20 min（D-生物素和维生素B1用0.22 μm无菌滤膜过滤除菌）。固体培养基添加琼脂2 g/100 mL。

赖氨酸补充培养基（[Lys]）：基本培养基补加100 μg/mL的L-赖氨酸。

无N基本液体培养基MM（-N）：葡萄糖2 g、K2HPO4 0.05 g 、MgSO4·7H2O 0.05 g、FeSO4·7H2O 0.02 g、MnSO4·H2O 0.02 g、D-生物素50 μg/mL、维生素B1 2 μg/mL，蒸馏水100 mL，pH 7.0~7.2，高压灭菌0.1 MPa，105 ℃，20 min（D-生物素和维生素B1用0.22 μm无菌滤膜过滤除菌）。

2N基本液体培养基MM（2N）：葡萄糖 2 g、(NH4)2SO4 0.8 g、尿素0.2 g、K2HPO4 0.05 g、MgSO4·7H2O 0.05 g、FeSO4·7H2O 0.02 g、MnSO4·H2O 0.02 g、D-生物素50 μg/mL、维生素B1 2 μg/mL，蒸馏水100 mL，pH 7.0~7.2，高压灭菌0.1 MPa，105 ℃，20 min（D-生物素和维生素B1用0.22 μm无菌滤膜过滤除菌）。

1.3 主要试剂

赖氨酸（L-Lys）、EMS、青霉素、5%硫代硫酸钠等，均购自天津为科生物技术有限公司。

2 实验内容

2.1 菌液制备

（1）菌体的活化与培养。将E.coli DH5a菌体接种在完全固体培养平板中， 37 ℃培养24 h活化菌体；用接种环挑取少量E.coli DH5a菌体，接种于盛有5 mL 完全培养液的试管中，37 ℃、180 r/min振荡培养过夜；第二天添加5 mL新鲜完全培养液，充分混匀后，分成2支试管，继续培养3~4 h。

（2）菌体收集与菌悬液制备。将培养后的菌液倒入灭菌离心管，4000 r/min离心10 min，弃上清，收集菌体，加入无菌生理盐水，如此操作洗涤2次，再用pH7.0的磷酸盐缓冲液将菌液稀释至108~109 cfu/mL[10]。

2.2 诱变处理

（1）紫外诱变处理。提前打开15 W紫外灯稳定30 min，吸取上述菌液4 mL于直径6 cm培养皿内，206

实验技术与管理

轻轻震荡使其均匀在皿底形成一薄层。将待处理的培养皿平放在紫外诱变箱内，使其距离紫外灯垂直距离为28.5 cm[11]，打开皿盖放在紫外灯下分别处理0、10、20、30、40、50、60、70、80、90 s，每次诱变做3个平行实验。照射完毕后，取未经UV照射的菌悬液（对照组）和不同UV照射时间的菌悬液各0.1 mL进行梯度稀释，选择合适浓度涂CM平板，锡箔纸包裹好，置37 ℃培养箱内避光培养24 h，计算致死率。致死率=（处理前存活细菌数–处理后存活细菌数）/处理前存活细菌数×100%。选择致死率在80%左右的紫外照射时长作为最佳诱变条件。加入4 mL加倍肉汤培养基于上述处理后的培养皿中，锡箔纸包裹好，置37 ℃培养箱内避光培养18 h左右。

（2）EMS诱变处理。分别取1、3、5、7和9 μL EMS原液（1 mg/mL）加入培养液中，制成1 mL菌悬液，使EMS的终浓度为1、3、5、7和9 μg/mL，37 ℃、150 r/min分别诱变处理5、10、15、20、25、30 min[12]，每次诱变做3个平行实验。诱变结束后向上述离心管中加入 1 mL 5%的硫代硫酸钠溶液处理10 min以解除EMS作用[13]。5000 r/min离心8 min，用1.0 mL无菌生理盐水重新悬浮，如此用无菌生理盐水洗涤菌体3次。取未经EMS诱变的菌悬液（对照组）和不同EMS诱变浓度的菌悬液进行梯度稀释，选择合适的稀释度涂布[Lys]平板，每个平板涂布0.1 mL 菌悬液。37 ℃恒温倒置培养 24 h后，进行菌落计数，分别计算致死率。

（3）UV-EMS复合诱变处理。选择上述实验得到的最佳紫外诱变剂量和最佳EMS诱变剂量进行复合诱变[3,14]。先将菌悬液在距离28.5 cm的15 W紫外灯下照射一定时间，然后将紫外诱变后的菌液用一定浓度的EMS 37 ℃处理一定时间，用5%的硫代硫酸钠溶液解除EMS作用。将处理后的菌液离心，用无菌生理盐水洗涤3次以终止EMS作用，最后用无菌生理盐水重悬。

2.3 青霉素法浓缩Lys–突变株

（1）过渡培养。分别取上述经最佳紫外诱变、EMS诱变及复合诱变处理后的菌悬液，以5%接种量接入20 mL液体[Lys]中，于37 ℃、180 r/min摇床培养3~5 h，使细胞几代，排除表型延迟对实验结果的影响，使缺陷型突变株表型能够充分表现。

（2）无N基本培养基饥饿培养。分别取上述中间培养液5 mL，5000 r/min离心10 min，收集菌体，无菌生理盐水洗涤2次后，重悬于5 mL无菌生理盐水中，转接至100 mL无N基本培养基中，37 ℃、180 r/min振荡培养，每隔1 h测量OD600（在600 nm 波长处的吸光值）至菌液浓度基本不再增加[15]，以消耗菌体内残留的氮源（尤其是氨基酸类氮源）。

（3）青霉素淘汰野生型。青霉素能够抑制生长中细菌细胞壁骨架结构的形成，破坏生长中的细菌细胞壁，从而杀死生长中的细菌，其对不生长的细菌没有致死作用。因此，在含有青霉素的基本培养基中，野生型菌株因能够生长而被杀死淘汰，营养缺陷型菌株因不能生长而被保留达到浓缩的目的。分别向上述饥饿培养液中补加等体积的2N基本液体培养基，37 ℃、180 r/min振荡培养，通过测菌液OD600监测细胞生长状态，使野生型菌株达到旺盛生长期。无菌操作下向培养液中加入过滤除菌的青霉素溶液，使其工作浓度为100 μg/mL，继续培养，每30 min镜检一次。以原生质体球化率达到50%~60%作为停止青霉素作用的指标[15]。分别取2 mL菌液，5000 r/min离心10 min，收集菌体，用等体积无菌生理盐水重新悬浮，如此洗涤3次，以终止青霉素的作用，并洗去因原生质体破裂而释放的营养物质。将离心洗涤后的菌体重悬于2 mL生理盐水中，制成菌悬液备用。

2.4 Lys–突变株的筛选

（1）Lys–突变株的初筛。分别取以上菌悬液进行梯度稀释，选择合适的浓度涂布[Lys]平板，每个平板涂0.1 mL菌悬液，37 ℃恒温培养48 h。采用逐个检出法进行初筛，用灭菌牙签将长出的又圆又小的菌落，分别先后点种MM 平板，再点种[Lys]平板，37 ℃恒温继续培养 48 h。

（2）Lys–突变株的复检。采用划线法对Lys–突变株进行复检。挑选在 MM 平板上不生长或生长不良，而在[Lys]平板上生长良好的菌落，在 MM 平板上划线复证，并在[Lys]平板上保留相应菌株的备份，37 ℃培养 48 h，观察在两种平板上菌株的生长情况。在MM 平板上不生长或生长不良，而在[Lys]平板上生长良好的菌株可判断为Lys–突变株。

2.5 Lys–菌株传代稳定性实验和检出率的测定

将经过复检的菌株在[Lys]平板上连续传代培养3次，每次37 ℃恒温培养24 h，再用划线法检测Lys–突变株的稳定性。计算不同诱变方法获得的Lys–突变株的检出率，Lys–检出率=（最终得到的Lys–突变菌株数量/初筛挑取的菌株数量）×100%。

3 实验结果与分析

3.1 紫外诱变条件的确定

使用15 W紫外灯、照射距离为28.5 cm，待诱变菌悬液浓度为108 cfu/mL。将照射0~90 s的菌悬液进行梯度稀释后涂布[Lys]平板，37 ℃培养24 h后统计菌落数，计算不同诱变时间下的致死率。紫外诱变结果如图1所示。

颜菲，等：紫外和EMS诱变选育大肠杆菌赖氨酸营养缺陷型突变株的综合实验设计与实践 207

图1紫外诱变时间及致死率

可以看出，随着诱变时间延长，致死率逐渐增加，且当紫外诱变时间在0~60 s时，致死率随诱变时间延长而快速增加；诱变时间为60 s时，致死率是81.21%；之后随诱变时间延长，致死率增加缓慢。一般选择致死率为80％左右的紫外诱变时长为最佳诱变条件，因此确定最佳紫外诱变条件是在15 W紫外灯下28.5 cm 处垂直照射60 s。

3.2 EMS诱变条件的确定

将1、3、5、7和9 μL EMS原液加入1.0 mL菌悬液（菌悬液浓度约为108 cfu/mL；EMS终浓度为1、3、5、7和9 μg/mL），37 ℃、150 r/min诱变处理5、10、15、20、25、30 min后，计算不同EMS诱变剂量的致死率。不同EMS诱变浓度及时间条件下的致死率如图2所示。

图2 EMS诱变剂量及致死率

可以看出，相同的诱变时间，致死率随EMS浓度的增加而升高；相同的EMS诱变浓度，致死率随诱变时间的延长而逐渐上升。当EMS用量是7 μg/mL、诱变时间是15 min时，致死率是80.27%，选择该EMS 诱变剂量作为最佳EMS诱变条件。

3.3 UV-EMS复合诱变条件的确定

根据紫外诱变结果及EMS诱变结果，确定复合诱变条件是：先将菌悬液在距离28.5 cm的15 W紫外灯下照射60 s，然后将紫外诱变后的菌液用7 μg/mL 的EMS 在37 ℃下诱变处理15 min。

3.4 无N饥饿培养时间的确定

无N饥饿培养的目的是消耗野生型菌株和Lys–

突变株菌体内残留的氮源，尤其是氨基酸类的氮源。

若无N饥饿培养时间过短，菌体内氮源不能完全消耗，

在后续加入青霉素后Lys–突变株会继续生长而被杀

死；若无N饥饿培养时间过长，菌体发生自溶的细胞

数会增加，其自溶后释放出的营养物质可以为Lys–突

变株提供生长因子，同样会使Lys–突变株在加入青霉

素后被杀死。因此确定适宜的无N培养时间可以有效

提高后续青霉素法淘汰野生型和浓缩缺陷型的效率。

通过测定无N培养菌液OD600值来监测菌体生长

情况。当菌体浓度基本不再增加，即培养液OD600值

基本不再变化时，可认为菌体已完全消耗自身所带氮

源，使得菌体已不再生长。因此，我们将培养液OD600

值不再变化作为无N培养的终止条件。UV诱变、EMS

诱变及UV-EMS复合诱变的菌株无N培养情况如表1

所示。

表1不同方法诱变菌株在不同饥饿培养时间的OD600值

饥饿培养时间/h

诱变方法

0 1 2 3 4 5

UV诱变0.0990.1110.149 0.161 0.1630.163

EMS诱变0.0770.0800.0 0.100 0.1030.103

复合诱变0.0420.0490.072 0.088 0.00.0结果显示，UV诱变、EMS诱变和UV-EMS复

合诱变都是在无N培养4 h时培养液OD600值基本不

再变化，因此确定不同诱变方法的无N培养时间都

是4 h。

3.5 青霉素处理前2N培养时间的确定

青霉素处理前2N培养的主要目的就是使野生型

细胞进入生长最旺盛的时期，以利于后续加入青霉素

提高作用效率。前培养时间过短会影响青霉素的作用

效率，而前培养时间过长则会导致已生长的细胞发生

自溶，释放出的营养物质会促使Lys–突变株开始生长。

UV诱变、EMS诱变及复合诱变菌株的青霉素处理前

2N培养情况如表2所示。

表2不同方法诱变菌株在不同青霉素处理前

2N培养时间的OD600值

青霉素处理前2N培养时间/h

诱变方法

0 1

2

3 UV诱变 0.075 0.096

0.208

0.288

EMS诱变0.046 0.062

0.142

复合诱变0.037 0.060

0.118208

实验技术与管理

通常认为，当OD600值增加至初始值的3~4倍时，

细胞应了2~3代，这时大部分野生型细胞处于生

长最旺盛时期，且细胞发生自溶的可能性较低，有利

于青霉素的作用效果[15]。结果显示，UV诱变菌株在

加入青霉素前2N培养2 h时培养液的OD600值是初始OD600值的2.8倍，培养3 h时OD600值是初始值的3.8倍，因此确定UV诱变菌株青霉素处理前2N培养时

间是3 h左右。EMS诱变和复合诱变菌株青霉素处理

前2N培养2 h时OD600值分别是初始值的3.1倍和3.2倍，因此EMS诱变和复合诱变菌株青霉素处理前2N

培养时间确定为2 h左右。

3.6 青霉素处理时间的确定

青霉素处理时间也是本实验关键参数之一，处理

时间过短不能有效杀死野生型菌株；处理时间过长又

会导致营养缺陷型菌株获得率下降。青霉素处理时间

的衡量指标较难把握。研究发现，当青霉素处理后的

菌液中50%~60%的细胞转化为原生质球时，得到的营

养缺陷型突变株的效率较高[15]。因此，通过镜检培养液，当细胞中50%~60%转化为原生质球时终止青霉素

处理。镜检UV诱变、EMS诱变及复合诱变菌株在加

入青霉素后的原生质球化情况如表3所示。

表3 不同方法诱变菌株青霉素不同作用

时间原生质球化率%

青霉素不同作用时间/min

诱变方法

0 30 60 90 120 UV诱变0 24 52 60 78 EMS诱变0 19 48 56 75 复合诱变0 21 50 58 75 镜检结果显示，UV诱变、EMS诱变和UV-EMS

复合诱变都是在加入青霉素后60~90 min范围内，培

养液中50%~60%的细胞转化为原生质球，因此将不同

诱变方法的青霉素处理时间确定为75 min左右。

3.7 Lys–突变株的初筛及复检

将UV诱变、EMS诱变和复合诱变处理后的菌株

涂布[Lys]平板，采用逐个检出法进行初筛，分别挑取

单菌落216个、256个和109个，先后点种在MM平

板和[Lys]平板上。选择在MM平板上长势很弱，而在[Lys]平板上生长良好的疑似缺陷型菌株进行划线对

照复检。

UV诱变后挑取的216个菌落初筛后得到8株疑

似菌株，复检后有6株在[Lys]平板上生长良好而在MM培养基上基本不生长，初步判断为Lys–突变株，

编号分别是UV-2、UV-4、UV-5、UV-6、UV-7、UV-8；EMS诱变后挑取的256个菌落初筛后得到12株菌株，

复检后有9株疑似Lys–突变株，编号是EMS-1、EMS-2、EMS-4、EMS-5、EMS-6、EMS-8、EMS-9、EMS-10、EMS-12；UV-EMS复合诱变后挑取的109个菌落初筛后得到7株菌株，复检后有5株疑似Lys–突变株，编号分别是UE-1、UE-2、UE-3、UE-5、UE-6。不同诱变方法疑似Lys–突变株复检结果如图3所示。

图3 不同诱变方法Lys–复检结果

3.8 Lys–突变株稳定性分析

将上述不同诱变方法复检后得到的疑似Lys–突变株在[Lys]平板上传代培养3次，每代培养24 h，采用划线对照法进行稳定性检测。结果显示：UV诱变复检后得到的6株疑似菌株中，UV-4恢复成原养型，其余5株UV-2、UV-5、UV-6、 UV-7和UV-8表现为Lys–性状，遗传稳定性良好，因此经UV诱变得到的Lys–突变株检出率为2.31%；EMS诱变复检后得到的9株菌株有8株（EMS-1、EMS-2、EMS-5、EMS-6、EMS-8、EMS-9、EMS-10、EMS-12）遗传稳定性良好，EMS诱变Lys-突变株检出率为3.13%；UV-EMS复合诱变复检后得到的5株菌株（UE-1、UE-2、UE-3、UE-5、UE-6）均没有恢复原养型，遗传稳定性良好，复合诱变Lys–突变株检出率为4.59%。

4 实验结论与讨论

本实验通过UV诱变、EMS诱变和UV-EMS复合颜菲，等：紫外和EMS诱变选育大肠杆菌赖氨酸营养缺陷型突变株的综合实验设计与实践 209

诱变E.coli DH5a菌株，对UV和EMS诱变条件进行了优化。最佳UV诱变条件是：15 W紫外灯、诱变距离28.5 cm、诱变时间60 s；最佳EMS诱变条件是：EMS浓度7 μg/mL、诱变时间15 min、诱变温度37 ℃。采用青霉素法淘汰野生型菌株，经过逐个检出法进行初筛、划线对照法进行复检，最终UV诱变得到5株较稳定的Lys–突变株（检出率2.31%）、EMS诱变得到8株较稳定的Lys–突变株（检出率3.13%）、UV-EMS 复合诱变得到5株较稳定的Lys-突变株（检出率4.59%）。

本实验对青霉素淘汰野生型菌株的系列步骤（如青霉素处理前无N培养时间、2N培养时间、青霉素作用时间等）关键参数的确定，从理论和实践上进行了探讨，使这些重要参数的确定可以通过测定培养液OD600值、镜检细胞原生质球化率等指标进行量化，相比传统实验大多凭经验的做法，提高了实验的可控性和应用性，提高了诱变效率。同时，通过比较不同诱变方法选育得到的赖氨酸营养缺陷型稳定菌株的检出率，发现复合诱变效率高于EMS诱变和UV诱变，复合诱变是获得营养缺陷型菌株的高效诱变方法。

5 实验的实施

5.1 实验的教学组织

不同于传统微生物实验教学以教师为主导的教学模式，本实验的实施充分重视学生的主体地位。每个项目小组由2~4名学生组成，基于给定的题目，先通过查阅互联网资源、文献资料等拟定预实验方案，再通过与指导教师讨论，对实验方案进行可行性分析、修改，形成最终实验方案[16]。实验课程结束后，指导教师根据学生在实验方案设计、实验准备、实验实施过程、出勤率、成果展示等方面的表现，进行综合考核评价，并基于学生对实验教学质量和教学效果的满意度评价体系，持续推动课程改进创新。

5.2 教学效果评价分析

（1）建立和完善综合评价考核体系。本实验课程共计72学时，为期一周。实验结束后，指导教师秉承公平合理的原则对学生的实验技能和综合素质从多角度进行综合考核，并给予客观评定。①平时成绩20%：考查学生课堂表现、出勤情况、课堂活跃度等。②实验设计20%：考查实验方案设计的可行性及实验实施开展情况。③实验技能40%：考查学生实验操作水平及实验过程中分析问题和解决问题能力。④实验论文及成果展示20%：考查实验论文撰写情况，包括结构规范、表述清楚、内容全面具体、实验结果分析讨论正确，以及答辩多媒体课件内容完整、讲解清楚。

（2）学生满意度调查。实验考核结束一周后，在参加实验课程设计的全部30名学生中进行了实验教

学质量和教学效果满意度问卷调查，问卷反馈率

100%。问卷调查结果显示（见表4），100%的学生认

为，自主设计实验方案有利于提高文献查阅能力；

96.7%的学生认为，该实验课程有助于理解紫外诱变、

化学诱变及青霉素法淘汰野生型细菌等实验理论的原

理，实验操作技能、论文撰写能力和表达能力同时得

到提升；93.3%的学生表示，经过课程设计实践，学

习能力和分析问题、解决问题的能力得以提升。

表4 学生满意度调查%

项目

非常

满意

满意一般不满意

非常

不满意

提高查阅文献的能力 53.3

46.7

提高实验操作技能 50.0

46.7

3.3

有助于理解实验原理 50.0

46.7

3.3

提升自学能力 53.3

40.0

6.7

0 提高分析问题解决问题能力 43.3 50.0 6.7 0 0

提高论文撰写水平及表达能力33.3 63.4 3.3 0 0

6 结语

作为生物信息学与生物技术专业毕业年级本科生

生物学综合实验课程，本实验能够帮助学生系统深入

理解微生物学和遗传学相关实验概念及原理；融会贯

通以往学习的相关实验操作技术，特别是无菌操作、

细菌培养、梯度稀释、紫外诱变、化学诱变、原生质

球制备等常规实验技术；熟悉可见分光光度计、光学

显微镜、高压灭菌锅、细菌培养箱等实验仪器设备的

使用操作方法，为后续本科毕业论文工作的顺利开展

奠定良好基础。

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