高效液相色谱法同时测定滁菊样品中的9种酚酸

高效液相色谱法同时测定滁菊样品中的9种酚酸

谢越1　俞浩2　汪建飞*1　张祖亮3　陈世勇1　肖新1　李孝良1

1

(安徽科技学院城建与环境学院,凤阳233100)

2

(安徽科技学院食品药品学院,凤阳233100)　　

3

(六安市食品药品检验所,六安237009)

摘　要　建立了高效液相色谱同时测定滁菊样品中9种酚酸类化合物(水杨酸㊁苯乙酸㊁对羟基苯甲酸㊁香草醛㊁对香豆酸㊁阿魏酸㊁苯甲酸㊁丁香酸和肉桂酸)的方法㊂采用Symmetry C 18色谱柱(250mm ×4.6mm,5m m )分离,流动相为乙腈和0.02mol/L 磷酸盐缓冲溶液,以冰醋酸调至pH 2.8,进样量20m L ,采用梯度洗脱,流速为1.0mL/min ,柱温25℃,检测波长280nm ㊂各组分的质量浓度与其峰面积具有良好的线性关系,相关系数均大于0.999,且9种酚酸组分在35min 内得到了较好分离㊂9种酚酸的检出限介于0.01~0.08mg/L ,平均回收率在97.8%~102.5%之间,相对标准偏差为0.2%~3.6%㊂本方法可用于滁菊样品中酚酸类化合物的快速分析㊂

关键词　高效液相色谱;酚酸;滁菊

　2012⁃08⁃12收稿;2012⁃10⁃17接受

本文系国家自然科学基金(No.31101598)㊁安徽省高校省级自然科学研究项目(Nos.KJ2012B055,KJ2012ZD04,KJ2012A067)和安徽科技学院引进人才项目(No.ZRC2012320)资助*E ⁃mail:jykwjf@sina.com

1　引　言

酚酸是指结构中带有酚类基团的有机酸,它是植物中仅次于黄酮类化合物的第二大次生代谢

物[1]㊂植物根系分泌物或植物残体腐解物中的酚酸是重要的化感物质,连续种植同种甚至近缘植物,酚酸物质会过度累积,引起植物产量降低,品质下降,病虫害增加,农业上称之为连作障碍[2]㊂近年来,由酚酸类物质导致的连作障碍问题成为研究热点㊂

目前,用于酚酸类化合物分析的方法主要有纸色谱(Paper chromatography,PC)㊁薄层色谱(Thin layer chromatography,TLC)㊁气相色谱(Gas chromatography,GC)㊁高效液相色谱(High performance liquid

chromatographic,HPLC)[3]㊁毛细管电泳(Capillary electrophoresis,CE)和胶束毛细管电动色谱(Micellar

electrokinetic chromatography,MEKC)等[4]㊂在各种酚酸分析方法中,纸色谱(PC)和薄层色谱(TLC)所费时间较长,一般要几到几十小时;因为酚酸具有沸点较高,不容易气化的特点,运用气相色谱(GC)技术检测时,需先对酚酸物质衍生后再测定,过程相对繁琐;毛细管电泳(CE)灵敏度较低,而胶束毛细管电动色谱(MEKC)成本较高均不适合酚酸类物质的分析检测㊂高效液相色谱法具有分析时间短,结果准确可靠等特点,近几年来得到了迅速发展㊂Chou 等利用高效液相色谱技术在水稻秸秆腐解液和根系分泌物中检测出大量酚酸类物质[5],Hao 等利用高效液相色谱技术从西瓜组织和根系分泌物中发现以阿魏酸为主的自毒物质存在[6],王祥军等利用反相高效液相色谱法快速测定了大麦籽粒中

13种酚酸类化合物[7]㊂尽管如此,高效液相色谱法在分析酚酸的过程中,也存在色谱条件优化的问题,尤其在同测定多种酚酸类物质的时候更为明显㊂

滁菊(Dendranthema morifolium (Ramat)Tzvel.cv.Chuju)为国家地理标志产品,因具有良好的药用功效,被誉为我国 四大药菊”之首㊂近年来,滁菊种植也出现了连作障碍问题,其中一个原因就是由于酚酸类物质的存在[8]㊂检测这些酚酸化合物对于解决滁菊连作障碍问题具有重要意义㊂本研究采用高效液相色谱法,通过对色谱条件的优化,建立了一种简单快速且适合大批量样品中9种酚酸类化合物的分析方法,为滁菊样品中酚酸类化合物的检测提供了技术支持㊂

第41卷2013年3月

分析化学(FENXI HUAXUE )　研究报告Chinese Journal of Analytical Chemistry

第3期383~388

2　实验部分

2.1　仪器与试剂

600⁃2487高效液相色谱仪(美国Waters 公司);可变波长紫外检测器;水相针式过滤器,超纯水电阻

率为18.2M W cm 2;pHS ⁃3C 精密pH 计(上海雷磁);万分之一电子天平(梅特勒⁃托利公司)㊂酚酸标准样品:水杨酸㊁苯乙酸㊁对羟基苯甲酸㊁香草醛㊁对香豆酸㊁阿魏酸㊁苯甲酸㊁丁香酸和肉桂酸,均为分析纯试剂(Sigma 公司);甲醇和乙腈(色谱纯,德国Fisher 公司);其余试剂均为国产分析纯㊂

2.2　酚酸标液的配制

分别准确称取9种酚酸,用2mL 甲醇溶解后,加入超纯水定容至100mL ,分别配制成单个酚酸溶液和混合标准样品母液,临用时稀释为0.5,1,5,10,20和40mg/L 的混合标准液㊂

2.3　色谱条件

Symmetry C 18色谱柱(250mm ×4.6mm,5m m );柱温25℃,检测波长280nm ;采用A 和B 双泵系统,流速1.0mL/min ;进样量20m L ㊂流动相A 为乙腈,流动相B 为0.02mol/L 磷酸盐缓冲溶液(以冰醋酸调至pH 2.8)㊂采用梯度洗脱:0~10min ,5%A ;10~25min ,15%A ;25~35min ,40%A ;35~40min ,35%A ;40~45min ,35%~5%A ㊂2.4　样品的制备

将整株滁菊样品置于温室内风干,取100g 干样剪成小段放入烧杯中,加入1000mL 无菌水,于45℃烘箱中浸泡15d ,纱布过滤,将滤液以10000r/min 离心,取上清液于80℃条件下旋转浓缩至原来体积的1/2,此液体为滁菊植株的腐解液㊂将连作4年滁菊的土壤阴干后过筛,按1∶10(w /V )的比例用去离子水浸泡72h ,间歇振荡㊂过0.45m m 滤膜后,放置4℃冰箱中备用,此液体样品即为滁菊连作土壤浸提液㊂

2.5　数据收集与处理

从高效液相色谱Workstation 采集的信号以文本文档格式(*.txt )输出,导出的原始数据用Origin 7.5软件绘图㊂3　结果与讨论

3.1　色谱条件优化

3.1.1　流动相的选择　利用高效液相色谱法测定酚酸的报道很多,但是实验中所用的流动相种类㊁pH 值有很大差别㊂常用的流动相有3%冰醋酸⁃甲醇溶液[9]㊁甲醇+0.1%冰乙酸⁃水或0.1%冰醋酸[10]㊁100%甲醇⁃0.1%甲酸溶液[7]㊁甲醇⁃水⁃冰醋酸(10∶88∶2,V /V )或甲醇⁃水⁃冰醋酸(90∶8∶2,V /V )[11]㊁乙腈⁃10

mmol/L 已烷磺酸钠⁃磷酸盐缓冲液[12]和0.1%H 3PO 4⁃0.1%磷酸乙腈溶液[13]等,pH 值从2.0变化到4.2㊂由于酚羟基和羧基在水溶液中容易发生电离,极性增强,在固定相表面形成双重保留,色谱峰拖尾严重,如果加入少量酸性调节剂,可使多酚的电离受到抑制,以中性分子的形态存在,极性减弱,有利于增强在固定相上的保留,使分离效果和峰形得到改善[14]㊂酸性调节剂有多种选择,如甲酸㊁冰醋酸㊁三氟乙酸㊁

H 3PO 4等,本实验选择常用的冰醋酸作为酸性调节剂,调节至pH =2.8㊂通过对文献中流动相的比较,最终采用乙腈⁃0.02mol/L 磷酸盐缓冲液(冰醋酸调至pH 2.8)为流动相,并采用梯度洗脱技术,可以将9种酚酸混合标准样品有效分离㊂

3.1.2　柱温的选择　色谱柱温度对酚酸的保留时间有较大影响(图1)㊂升高柱温可明显提高各酚酸组分的分离度㊂然而,当温度为35℃时,阿魏酸和苯甲酸两种组分无法有效分离;柱温为40℃时,丁香酸和阿魏酸无法分离㊂继续提高温度虽然可以有效缩短各组分的保留时间,但温度太高对色谱柱不利㊂因此,在保证各酚酸组分有效分离的前提下,实验中柱温选择为25℃㊂3.1.3　流速的选择　流速是色谱条件中的重要因素㊂流动相流速增加,可以使得样品分析测试时间缩短,但流速过快也会使待测样品组分的分离效果变差[7]㊂本实验尝试了0.5,1.0和1.5mL/min 3个流速㊂

在1.5mL/min 流速下,对羟基苯甲酸㊁香草醛和对香豆酸3种组分无法分离;在0.5mLmin 流速下,分析483　　分析化学第41卷

测试时间较长;而1.0mLmin 流速既可以有效分离6种酚酸组分,分析时间相对较短㊂因此,最终流速选定为1.0mL/min ㊂

3.1.4　色谱条件的确定　根据优化结果,确定了实验的色谱条件㊂图2即为9种酚酸混合标准样品的色谱图,各酚酸组分的保留时间见表1㊂对于酚酸类化合物的分析,保留时间决定了分析时间的长短㊂刘江云等分离12种酚酸约需40min [15];Ross 等分离11种酚酸[16],陈建业等分离11种酚酸[17],Nardini 等分离14种酚酸均约需50min [18];Hernanz 等分离18种羟基肉桂酸衍生物和阿魏酸脱羟二聚物约需80min [19]㊂本研究中所有组分在35min 内得到了较好的分离㊂相对于文献报道的方法,本方法的分析测试时间较短

㊂

　图1　柱温对保留时间的影响

Fig .1　Effect of column temperature on retention time

1.水杨酸;

2.苯乙酸;

3.对羟基苯甲酸;

4.香草醛;

5.对香豆酸;

6.阿魏酸;

7.苯甲酸;

8.丁香酸;

9.肉桂酸㊂

1.Salicylic acid;

2.Phenylacetic acid;

3.p ⁃Hydroxybenzoic acid;

4.Vanillin;

5.p ⁃Coumaric acid;

6.Ferulic acid;

7.Benzoic acid;

8.Syringic acid;

9.Cinnamic

acid.

　图2　9种酚酸混合标准样品的色谱图Fig .2　Chromatograms of a mixture of 9phenolic acid

standards

峰号同图1(The peak number is the same as in Fig .1)㊂

3.2　线性关系和检出限

分别配制含有9种酚酸组分的系列标准样品溶液,在优化的实验色谱条件下依次进样,重复3次,以峰面积为纵坐标(y ),质量浓度为横坐标(x ),计算每个酚酸组分的回归方程㊁相关系数和线性范围㊂结果见表1,以仪器信噪比(S /N =3)确定9种酚酸的检出限㊂

表1　9种酚酸组分的保留时间㊁回归方程㊁相关系数㊁线性范围和检出限

Table 1　Retention times,regression equations,correlation coefficients,linear ranges and detection limits of 9phenolic acids

酚酸Phenolic acid 保留时间Retention time

(min )

回归方程

Regression equation 相关系数Correlation coefficient 线性范围Linear range (mg/L )检出限Detection limit (mg/L )

水杨酸Salicylic acid 12.05y =87366x +3623.40.99960~.220.08苯乙酸Phenylacetic acid 14.29y =76639x -8463.30.99980~31.170.01对羟基苯甲酸p ⁃Hydroxybenzoic acid 18.21y =90331x +2231.60.99990~105.70.03香草醛Vanillin 20.23y =35772x +8840.90.99950~.550.04对香豆酸p ⁃Coumaric acid 25.16y =79747x +16.70.99980~45.290.02阿魏酸Ferulic acid 27.17y =100376x +7542.40.9999 3.58~121.80.06苯甲酸Benzoic acid 28.52y =906511x -8734.50.99990~58.090.03丁香酸Syringic acid 31.09y =67734x +4086.70.99970~68.150.03肉桂酸Cinnamic acid

31.99

y =86301x +6553.2

0.9999

5.73~9

6.42

0.04

　　从表1中可见,在一定样品浓度范围内,各酚酸组分质量浓度与峰面积相关性良好,相关系数均在

0.999之上,线性范围相对较宽,检出限介于0.01~0.08mg/L 之间,说明本实验方法具有较低的检测浓度,满足痕量分析要求㊂文献[7,20]的结果与本研究类似,利用液相色谱方法研究酚酸类物质,在色谱条件优化后,相关系数㊁线性范围和检测限方面均取得了较好的实验结果㊂

5

83第3期谢越等:高效液相色谱法同时测定滁菊样品中的9种酚酸

3.3　加标回收率和精密度

选取特定浓度的酚酸样品溶液,进样量为20m L ,重复6次,计算各酚酸组分的加标回收率和相对标准偏差(RSD ),结果见表2㊂从表2可见,各酚酸组分的平均回收率介于97.78%~102.5%之间,相对标准偏差为0.2%~3.6%,说明本方法具有重复性好㊁准确度高的特点㊂

表2　9种酚酸的加标回收率和精密度

Table 2　Recoveries of 9phenolic acids and precision of the method

酚酸Phenolic acid

添加量Added (mg/L )检测值Found (mg/L,n =6)

回收率Recovery (%,n =6)RSD (%,n =6)

水杨酸Salicylic acid 109.77.8 1.3苯乙酸Phenylacetic acid 4039.197.80.25对羟基苯甲酸

p ⁃Hydroxybenzoic acid 4040.2100.4 3.6香草醛Vanillin

4039.999.6 2.0对香豆酸p -Coumaric acid 1010.2102.50.17阿魏酸Ferulic acid 4040.0100.1 2.0苯甲酸Benzoic acid 4039.398.2 2.0丁香酸Syringic acid 4039.197.8 1.8肉桂酸Cinnamic acid

40

39.7

99.2

1.3

3.4　用同一流动相测定滁菊残体腐解液和连作4年滁菊土壤浸提液中酚酸含量

采用本方法测定了滁菊腐解液和连作滁菊土壤浸提液中9种酚酸组分的含量,色谱图见图3,检测结果见表3㊂图3显示,各酚酸组分在混合标样和液体样品中均有良好的分离度㊂样品分析结果表明,9种酚酸组分在连作4年土壤浸提液中全部检测出来,其中苯乙酸浓度最低(0.15m g /g),水

杨酸的浓度最高(21.09m g /g),苯乙酸㊁香草醛和对香豆酸3种酚酸在滁菊腐解液均未检出,

检出的剩　图3　标准酚酸样品(a)滁菊腐解液(b)和连作滁菊土壤浸提液(c)中酚酸检测的色谱图

Fig.3　Chromatograms of standard phenolic acids (a),Dendranthema morifolium (Ramat )Tzvel.cv.Chuju residues decomposed solution (b)and soil extraction of continuous cro pping for 4years(c)

峰号同图1(The peak number is the same as in Fig.1)㊂

余6种酚酸中,以水杨酸含量最高,达到了

48.63mg /L㊂

表3　滁菊腐解液和连作滁菊土壤浸提液中酚酸含量

Table 3　Content of phenolic acid in Dendranthema morifolium (Ramat)Tzvel.cv.Chuju residues decomposed solution and soil extract of continuous cropping for 4years

酚酸Phenolic acid

Sample I (mg /L)Sample II (m g /g)水杨酸Salicylic acid 48.621.1苯乙酸Phenylacetic acid ND 0.15对羟基苯甲酸p ⁃Hydroxybenzoic acid 25.29.77香草醛Vanillin ND 4.53对香豆酸p ⁃Coumaric acid ND 0.56阿魏酸Ferulic acid 5.9718.2苯甲酸Benzoic acid 1.340.丁香酸Syringic acid 0.690.23肉桂酸Cinnamic acid

18.4

3.87

样品I:腐解液;样品II:4年连作土壤水提液㊂Sample I:Dendran⁃thema morifolium (Ramat)Tzvel.cv.Chuju residues decomposed solu⁃tion;Sample II:the soil extract of continuous cropping Dendranthema morifolium (Ramat)Tzvel.cv.Chuju for 4years.

　　利用高效液相色谱研究土壤中的自毒化感物质文献报道很多㊂梁春启等

[21]

用1%醋酸与甲醇作为

流动相,采用二元梯度洗脱方式,在玉米秸秆腐解液检测出对羟基苯甲酸㊁苯甲酸㊁丁香酸㊁邻苯二甲酸㊁香草酸和阿魏酸共5种酚酸类物质,含量与本文基本在同一个数量级㊂苏贻娟等[22]也在玉米叶片中检测出香草酸㊁咖啡酸㊁丁香酸和香豆酸共4种酚酸㊂由此可见,利用同一种流动相的高效液相色谱法分析测试液体样品中的酚酸类物质的方法是可行可靠的㊂

本研究结果表明:可以用流动相为乙腈和0.02mol /L KH 2PO 4水溶液(冰醋酸调节pH 2.8),并采

用梯度洗脱技术(0~10min 为5%A;10~25min 为15%A;25~35min 为40%A;35~40min 为35%A;

40~45min 为5%A)㊂在280nm 波长下测定,35min 之内可以将水杨酸㊁苯乙酸㊁对羟基苯甲酸㊁香草醛㊁对香豆酸㊁阿魏酸㊁苯甲酸㊁丁香酸㊁肉桂酸9种酚酸有效分离㊂该方法精确度高,检出限低㊂但值得

683　　分析化学第41卷

注意的是,本方法针对的是Symmetry C 184.6×250mm 的色谱柱,并在柱温25℃,流速1.0mL /min 条件下,如果色谱柱㊁柱温和流速条件改变,必须再进行色谱条件的优化㊂References

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83第3期谢越等:高效液相色谱法同时测定滁菊样品中的9种酚酸

Liquid Chromatography

XIE Yue1,YU Hao2,WANG Jian⁃Fei1,*,ZHANG Zu⁃Liang3,CHEN Shi⁃Yong1,XIAO Xin1,LI Xiao⁃Liang1

1(College of Urban Construction and Environment,Anhui Science and Technology University,Fengyang233100,China) 2(Food and Drug College,Anhui Science and Technology University,Fengyang233100,China)

3(Lu′an Institute for Food and Drug Control,Lu′an237009,China)

Abstract　A method was developed for the simultaneous determination of nine phenolic acids in Dendran⁃thema morifolium(Ramat)Tzvel.cv.Chuju samples.Salicylic acid,phenylacetic acid,p⁃hydroxybenzoic acid,vanillin,p⁃coumaric acid,ferulic acid,benzoic acid,syringic acid and cinnamic acid were separated by high performance liquid chromatography(HPLC)on a Symmetry C18(4.6×250mm,5m m)column at25℃, Gradient elution was employed with a mobile phase consisting of acetonitrile and0.02mol/L potassium dihydrogen phosphate,and adjusted to pH2.8by acetic acid,a solvent flow rate of1.0mL/min and an injection volume of20m L.Nine phenolic acids compounds were identified at280nm.The method showed good linear correlations between the concentrations and peak areas of the9components with the correlation coefficients greater than0.999,and all of nine phenolic acids were separated well in35min.The detection limits of the components were0.01-0.08mg/L,and the average recoveries were97.78%-102.5%with relative standard deviations of0.2%-3.6%.The method can be applied to the rapid determination of phenolic acids in Dendranthema morifolium(Ramat)Tzvel.cv.Chuju with good repetition and precision. Keywords　High performance liquid chromatography;Phenolic acids;Dendranthema morifolium(Ramat) Tzvel.cv.Chuju

(Received12August2012;accepted17October2012

) 中药材高效液相色谱检定:‘中华人民共和国药典“

(2010年版)收载品种对应方法集

　　本书针对‘中华人民共和国药典“(2010年版)中用高效液相色谱进行鉴别㊁检查和含量鉴定的中药材品种,对药典收载的高效液相色谱方法进行了详细介绍,其中包括:药典收载情况㊁药材高效液相色谱行为㊁色谱条件的选用㊁仪器配置㊁对照品和样品的色谱图㊁定量标准曲线及重复性数据㊂

书号:9787122147578　定价:200.0元

开本:16,化学出业出版社出版,出版日期:2013年1月㊂