肽的结构分析——圆二色谱

      许多生物大分子都是手性分子。所谓手性就是具有不能重叠的三维镜像对应异构体。一般来说，凡具有手性的分子就具有旋光活性，这一点很早就认为人们所认识并广泛应用于研究分子的非对称性结构。振动方向在同一平面内的电磁波为平面偏振光。当一束平面偏光通过介质时，光学活性物质分子对左、右圆偏振光的吸收不同，其差值称为圆二色性。由于存在圆二色性，平面偏振光通过光学活性物质后，其两圆偏振光分量的强度将不同，它们合成的不再是平面偏振光，而是椭圆偏振光。吸收随波长的变化构成圆二色谱。圆二色谱仪利用这一原理，将平面偏振光调制成左圆偏振光和右圆偏振光，并以很高的频率交替通过样品，这两束圆偏振光通过样品产生的吸收差由光电倍增管接收检测。

       圆二色谱是快速确定蛋白质和肽二级结构的方法。在紫外区段主要的生色团是肽链，这一范围的圆二色谱包含着肽主链的构象信息。在近紫外区占支配地位的生色基团是芳香氨基酸侧链，这一区域的圆二色谱能给出局域侧链间相互作用的信息。在波长大于300nm的区域，包括可见光区，对圆二色谱的贡献主要来自含有金属离子的一类生色团，这一波段的圆二色谱对于金属的氧化态、配位体以及链一链相互作用均较敏感。不含非氨基酸发色团的肽和蛋白质在300nm以上没有吸收或圆二色谱带。

      通常由样品圆二色谱形状、谱峰位置、强度以及它们随时验条件的变化本身就可以得到很重要的结构信息。最主要的圆二色谱参量是谱峰位置及该处摩尔椭圆率。酰胺基是用圆二色谱观察肽和蛋白质的最重要的发色团。已确定它的两种电子迁移方式。n-π迁移通常很弱，在220nm附近呈一个负带。它的能量对氢键的形成敏感。π-π迁移一般较强，在192nm附近出现一个正带，在210nm附近出现一个负带。

       а-螺旋、β-折叠构象和不规则构象的比例可用圆二色谱确定。а-螺旋构象的特征是常在222nm和208nm处出现负带，在192nm处为一正带。短肽在溶液中通常不形成稳定的螺旋，但已表明加入2，2，2-三氟乙醇能使大多数肽的螺旋成分增加。如前文所述，与а-螺旋相比，β-折叠具有不确定性，可以平行或反平行方式形成，它的特征性圆二色谱是在216nm处有一负带，在接近195nm处，有一个相当大的正带。不规则构象的圆二色谱通常在200nm以下有一个较强的负带。

       虽然圆二色谱分析不像X线衍射分析那样能给出比较全面的绝对信息，并且它总是必须与标准相比较和利用X线衍射的结果。但它对构象变化灵敏，因此通过圆二色谱的观察和分析可以灵敏地检测一些反应引起的构象变化，并进一步进行半定量测定。由于常规圆二色谱仪所检测的光谱范围一般在200nm以上，丢失了200nm以下的重要信息，因此从远圆二色谱上一般得不到精确的结果。近10多年来，随着同步辐射光的出现，圆二色谱区的扩展已经成为现实。现在，利用同步辐射光作为光源，可以把圆二色谱区拓展到110-130nm，实现了真空紫外圆二色。此外，磁圆二色与振动圆二色的发展可以用来探测普通光谱学无法分辨的分子的多重跃迁及某些分子激发态的角动量，为圆二色技术的应用开辟了更为广阔的前景。