微生物检验方法(实用版)

一、  产品采集（依据GB 15979—2002）

采集：于同一批号的三个运输包装中至少抽取12个最小销售包装样品，1/4样品用于检测，1/4样品用于留样，另1/2样品必要时用于复检。抽样的最小销售包装不应破裂，检验前不得启开。

备注：微生物检验耗时长，平常的微生物控制一般为中包时登记生产日期，进行取样培养。

二、  培养基的制备与灭菌

1．营养琼脂培养基

制备：称量6.6g营养琼脂培养基置于500ml三角烧瓶中，加入150ml蒸馏水，搅拌均匀后，用50ml蒸馏水将玻棒上残留冲洗入三角瓶中，测量其PH值，要求为7.2︿7.4，置于酒精灯上均匀加热至沸腾，加热期间需不停搅拌直至完全融化，加热时，要加石棉网防止过热糊底，烧焦及溢出，融化过程中，要不时的加热蒸馏水补足所蒸发的水分（事先在三角瓶上液面处作一处标记）。

灭菌：制作合适尺寸塞塞紧三角烧瓶，用干净牛皮纸包扎瓶口后置于高压蒸汽灭菌锅中，调节121℃高压灭菌15分钟备用。

2．沙氏琼脂培育基

制备：称量14.0g沙氏琼脂培养基置于500ml三角烧瓶中，加入150ml蒸馏水，搅拌均匀后，用50ml蒸馏水将玻棒上残留冲洗入三角瓶中，置于酒精灯上均匀加热至沸腾，加热期间需不停搅拌直至完全融化，加热时，要加石棉网防止过热糊底，烧焦及溢出，融化过程中，要不时的加热蒸馏水补足所蒸发的水分（事先在三角瓶上液面处作一标记）。

灭菌：制作合适尺寸棉塞塞紧三角烧瓶，用干净牛皮纸包扎瓶口置于高压蒸汽灭菌锅中，调节115℃高压灭菌15分钟。

3．乳糖胆盐发酵管

制备：称量3.5g乳糖胆盐发酵管置于250ml三角烧瓶中，加入80ml蒸馏水，搅拌均匀后，用20ml蒸馏水将玻棒上残留冲洗入三角瓶中，测量其PH值，要求为7.3-7.5。置于酒精灯上均匀加热至沸腾，加热期间需不停搅拌直至完全融化，加热时，要加石棉网防止过热糊底，烧焦及溢出，融化过程中，要不时的加热蒸馏水补足所蒸发的水分（事先在三角瓶上液面处作一处标记）。

分装：将发酵管培养基分装于20*200试管中约1/3处，分装5管，分别加入一个小导管后用棉塞塞紧。

灭菌：用牛皮纸包扎5管试管后用棉线系紧，在115℃下高压灭菌15分钟备用。

4．SCDLP液体培养基

制备：称量3.8gSCDLP液体培养基置于250ml三角烧瓶中，加入80ml蒸馏水，搅拌均匀后，用20ml蒸馏水将玻棒上残留冲洗入三角瓶中，测量其PH值，要求为7.2︿7.3。置于酒精灯上加热至沸腾，加热期间需不停搅拌直至完全融化，加热时，要加石棉网防止过热糊底，烧焦及溢出，融化过程中，要不时的加热蒸馏水补足所蒸发的水分（事先在三角瓶上液面处作一处标记）。

分装：将SCDLP液体培养基分装于20*200试管中约1/3处，分装9管，分装完毕用棉塞塞紧。

灭菌：用牛皮纸包扎9管试管后用棉线系紧，在121℃下高压灭菌20分钟备用。

5．葡萄糖肉汤培养基

制备：称量3g葡萄糖肉汤培养基置于250ml三角瓶中，加入80ml蒸馏水，搅拌均匀后，用20ml蒸馏水将玻棒上残留冲洗入三角瓶中，测量其PH值，要求7.2-7.4。置于酒精灯上均匀加热至沸腾，加热期间需不停搅拌直至完全融化，加热时，要加石棉网防止过热糊底，烧焦及溢出，融化过程中，要不时的加热蒸馏水补足所蒸发的水分（事先在三角瓶上液面处作一处标记）。

分装：将培养基分装于20*200试管中约1/3处，分装5管，分装完毕后用棉塞塞紧。

灭菌：用牛皮纸包扎5管试管后用棉线系紧，在121℃下高压灭菌15分钟备用。

6．血液琼脂培养基

制备：称量4.5g血液琼脂基置于250ml三角烧瓶中，加入80ml蒸馏水，搅拌均匀后，用20ml蒸馏水将玻棒上残留冲洗入三角瓶中，测量其PH值，要求为7.0-7.4。置于酒精灯上均匀加热至沸腾，加热期间需不停搅拌直至融化，加热时，需加石棉网防止过热糊底，烧焦及溢出，融化过程中，要不时的加热蒸馏水补足所蒸发的水分（事先在三角瓶上液面处作一处标记）。

分装：将培养基分装于5个培养皿中，每个约15-20ml培养基。

灭菌：将培养皿置于高压蒸汽灭菌锅中，调节121℃高压灭菌15分钟后取出冷却至50℃左右，以无菌操作吸取无菌脱纤维兔血2ml加入每个瓶皿，摇匀，制成平板，贴上标签，箱内备用。

7．灭菌生理盐水的制备

取2.25gNaCl ( AR)加入500ml三角瓶中，再加入250ml蒸馏水，搅拌均匀后，塞上棉塞，用牛皮纸包扎好，放入121℃高压灭菌15分钟。

三、微生物检验步骤

1．用酒精棉球清洁超净台，把每个培养皿贴上标签，对于空白对照的培养皿贴上空白对照的标签；

2．将待测包装袋、培养基、灭菌生理盐水、灭菌三角瓶、移液管、洗耳球、镊子、酒精灯、酒精棉球、剪刀、电子称等实验操作必须用品置于超净工作台中，拉下玻璃门，开启高效过滤器和紫外线灯灭菌30分钟；

3．关闭紫外线灯，等待10分钟后拉起玻璃门，高度10cm，带上乳胶手套，用酒精棉球清洁双手、剪刀、包装袋热封处和镊子；

4．剪刀裁开3个包装袋热封处，从每个包装袋取样，准确称取10±lg样品，剪碎后加入200ml的灭菌生理盐水中，充分混匀，制成样液。如被检样品含有大量的SAP而导致不能吸出足够样液时，稀释液量可按每次50ml递增，直至能吸出足够的试用样液。在计算细菌菌落总数与真菌菌落总数时相应调整稀释度；

5．细菌菌落检测：移取上述样液的上清液5ml以无菌操作分别注入5个平皿中各1ml（留一个培养基作空白对照），然后用冷却至50左右的营养琼脂培养基15-20ml倒入每个平皿内混合均匀，待琼脂凝固后翻转平皿置35℃±2℃电热恒温培养箱中培养48小时，计算平板上的菌落数；

6．大肠杆菌检测：移取上述样液的上清液8ml，以无菌操作分别注入乳糖胆盐发酵管4管各2ml（留一个培养基作空白对照）轻摇管体混合均匀，至35℃±2℃电热恒温培养箱中培养24小时，观察其产酸产气情况，不产酸不产气则记录大肠杆菌阴性；

7．溶血性链球菌检测：移取上述样液的上清液8ml，以无菌操作分别注入葡萄糖肉汤培养基4管各2ml（留一个培养基作空白对照）轻摇管体混合均匀，置35℃±2℃电热恒温培养箱中培养24小时，将培养物划线接种血液琼脂平板，35℃±2℃培养24h，观察菌落特征；

8．绿脓杆菌检测：移取上述样液的上清液8ml以无菌操作分别注入SCDLP液体培养基4管各2ml（留一个培养基作空白对照）轻摇管体混合均匀，置35℃±2℃电热恒温培养箱中培养18-24小时；

9．金黄色葡萄球菌检测：移取上述样液的上清液8ml以无菌操作分别注入SCDLP液体培养基4管各2ml（留一个培养基作空白对照）轻摇管体混合均匀，至35℃±2℃电热恒温培养箱中培养24小时，取上述增菌液1-2接种环，划线接种在血液琼脂培养基上，置35℃±2℃电热恒温培养箱中培养24-48小时；

10．真菌菌落检测：移取上述样液5ml，以无菌操作分别注入5个平皿中各1ml（留一个培养基作空白对照），然后用冷却至50左右的沙氏琼脂培养基15-20ml倒入每个平皿内混合均匀，待琼脂凝固后翻转平皿置25℃±2℃电热恒温培养箱中培养7天，分别于3、5、7天观察其平板，计算平板上的菌落数，如果发现菌落蔓延，以前次菌落计数为准；

四、 微生物计数、判定

1．细菌/真菌菌落总数=5个平皿的细菌菌落总数/5Ｘ稀释度（cfu/g）

稀释度=稀释液量/10

2．大肠杆菌生长表现为乳糖胆盐发酵呈现黄色，小导管内有气体导致上浮；

3．绿脓杆菌生长表现为SCDLP培养基表面呈现一层薄菌膜，培养基呈现黄绿色或蓝绿色；

4．金黄色葡萄球菌生长表现为血液琼脂培养基上菌落呈现金黄色、大而突起、圆形、不透明、表面光滑、周围有溶血圈；

5．溶血性链球菌生长表现为血液琼脂培养基上菌落灰白色，半透明或不透明，针尖状突起，表面光滑，边缘整齐，周围无色透明溶血圈；

五、 玻璃器皿的洗涤、包装和灭菌

1．洗涤

A、新使用的玻璃器皿用2%盐酸溶液浸泡过夜，用水冲洗，然后用洗衣粉水浸泡洗涤，再用水充分冲洗干净；

B、使用过的器皿应立即进行处理和洗涤，放置太久会增加洗涤的困难，使用过的吸管直接浸泡在盛有消毒液的玻璃缸中过夜，含有琼脂培养基的器皿，直接用沸水煮开融化后，然后用水冲洗，取出器皿在1%的新洁儿灭浸泡半小时以上，然后用水冲净；

C、洗涤载玻片和盖玻片，新使用的可先用2%的HCl溶液浸泡1h，用水冲洗干净后，再用蒸馏水洗2-3次。用过的载玻片或盖玻片（有油的玻片，先用二甲苯擦去油垢），放在盛有消毒剂的玻璃缸中，待积累到一定量后，取出用于清洗，在洗衣粉中煮沸10分钟，立即用水冲洗，再放进洗液中浸泡2h，水洗，最后用蒸馏水洗2次，烘干，冷却后浸于95%的酒精中备用。

D、对于三角烧瓶瓶底瓶口及试管口污垢，可用煮沸的40%的NaOH浸泡，立即用水清洗干净。

E、凡有传染性的器皿，洗涤前应经高压灭菌后清洗。

2．包装

A、移液管：将清洗干净干燥了的移液管，在每一管上端塞入一小段脱脂棉花，松紧适宜，长约1cm，防止菌液吸入口中和口中的微生物吸入管中，棉花塞好后，用报纸条从一端开始斜角试地先将尖端包好，而后卷包整支管体，余下长出管体的纸条要折好，不可使纸条松开；

B、培养皿：将清洁干净的培养皿5-10个用纸卷成一包，两端将余出的纸折好，不得使培养皿露出，再用绳子捆好。

C、试管和三角瓶的包装：试管和三角瓶都要事先做好棉塞，棉花塞的制作过程：先取一块棉花，在中间均匀对添一小块作芯，铺好后用五个手指抓紧中心，抓出一个球，余下的棉花塞进管内。棉花塞的长度不小于管口直径的两倍，约2/3塞进管内，要求棉花紧贴玻璃壁，没有皱纹和缝隙，不能过紧也不能过松。塞好棉塞后，用牛皮纸包扎棉头部，再用棉绳捆成一扎。

3．灭菌

包装好的玻璃器皿一般可放进140-160干燥箱中，保持2-3小时，进行干热灭菌后进行存放。

准备工作(灭菌生理盐水、灭菌培养基)→接种→ 培养→煮沸清洗→湿热灭菌（干燥）→包装→干热灭菌→存放

六、生产环境微生物控制

1．空气微生物控制

A、室内面积不大于30m2的空间对角线上设里、中、外三点，里、外点位置距墙1m，室内面积超过30m2，设东、西、南、北、中五点，周围4点距离墙1m。（均在动态下进行）

B、将灭菌好的营养琼脂培养基置电热恒温培养箱35培养24h，取出检查无污染的培养基，将其置于采样点（约桌面高度），打开平皿盖，使平板在空气中暴露5min。