实验四.小鼠骨髓细胞微核试验

实验四：小鼠骨髓细胞微核试验

1、实验目的

通过检测哺乳动物骨髓细胞中嗜多染红细胞（PCE）的微核出现率，间接反映骨髓细胞染色体畸变发生率的高低，从而判断受试动物是否具有致突变作用。主要用于测试干扰细胞有丝的物质。

2、实验原理

微核可以出现在多种细胞中，但在有核细胞中较难与正常核的分叶及核突出物相区别。红细胞在成熟之前最后一次分离后数小时可将主核排出，但微核仍保留于PCE细胞中，因此可通过计数PCE细胞中的微核来判断受试物的致突变作用。

3、实验材料

3.1实验动物 

7～12周龄健康小鼠，体重20~30g，10只，雌雄各半。

3.2试剂

小牛血清（灭活）；甲醇；姬姆萨染色液：磷酸盐缓冲液（pH 6.8）：丝裂霉素C。

3.3器材

生物显微镜、恒温水浴箱、解剖剪、镊子、止血钳、注射器、灌胃针头、载玻片、玻璃染色缸、塑料吸瓶、吸管、乳钵、干净纱布、滤纸等。

4、操作步骤

4.1试剂的配制

4.1.1小牛血清（灭活）  

小牛血清滤菌后置于56℃恒温水浴保温30 min进行灭活。

4.1.2磷酸盐缓冲液（pH 6.8）

1/15mol/L磷酸氢二钠溶液：磷酸氢二钠(Na2HPO4) 9.47 g溶于1000ml蒸馏水中;

1/15mol/L磷酸二氢钾溶液：磷酸二氢钾(KH2PO4) 9.07 g溶于1000ml蒸馏水中;

1/15mol/L磷酸氢二钠溶液50ml与1/15mol/L磷酸二氢钾溶液50ml混合即可。

4.1.3姬姆萨染色液  将Giemsa染料和少量甲醇于乳钵里仔细研磨，再加入甲醇至375 ml，待完全溶解后，再加入125ml甘油，混合均匀。置37℃恒温箱中保温48h。保温期间振摇数次，促使染料的充分溶解。取出过滤，即为姬姆萨储备液，两周后可使用。实验前取姬姆萨储备液与磷酸盐缓冲液（pH 6.8）1 : 9混匀，即可。

4.2 实验动物的处理

步骤如下:

（1）给药  根据急性LD50，选用使动物出现中毒，但不引起动物死亡的剂量，受试小鼠腹腔注射丝裂霉素C1.5～2mg/kg 

（2）骨髓细胞液的制备  在给与受试物6h后，小鼠脱颈椎处死，打开胸腔，沿着胸骨柄与肋骨交界处剪断，剥掉附着其上的肌肉，用滤纸擦干血污

（3）PCE及微核的观察

涂片  在洁净的玻片一端滴小牛血清1滴，横向剪开胸骨，暴露骨髓腔，然后用止血钳挤出骨髓液至血清中，混匀，推片（长度约2～3cm），在空气中晾干（一般以两节胸骨髓液涂一张片子为宜）

固定  将干燥的涂片置甲醇液中固定5～10min，取出晾干

染色  固定好的涂片放入姬姆萨应用液中染色15～30min，蒸馏水冲洗，干燥

镜检  先在低倍镜下观察，选择分布均匀，染色较好的视野，然后换到油镜下观察计数。成熟的红细胞呈桔黄色，而嗜多染红细胞呈灰蓝色。微核呈圆形或椭圆形、单个或多个、边缘光滑整齐，染色与核一致，呈紫红色或蓝紫色。一个细胞内有出现一个或多个微核的情况。但是视野中观察到的微核数目太少，不具有统计学意义。

5、讨论 

丝裂霉素C为细胞周期非特异性药物，可使细胞的DNA解聚并阻碍DNA的复制，因此本次试验给药后应该能够观察到可以计数并统计的微核数目。

但是实验结果只观察到数量极少的微核，不具有统计学意义。

原因可能是实验过程中所取小鼠骨髓细胞量不足，推片后用甲醇固定时间不足，在染色后冲洗时会使细胞受到影响。